"O objetivo do curso de histologia é levar o estudante a compreender a microanatomia das células, tecidos e órgão e correlacionar a estrutura com a função." (Ross e Pawlina, 2016)
Histologia é uma palavra derivada do grego (Histos = tecidos; logia = ciência) que também é conhecida como anatomia microscópica. Atualmente, além de descritiva, a histologia é uma ciência que inclui muitos aspectos da biologia molecular e celular, o que promoveu um grande avanço nas descrições da organização e função das células. Os histologistas adotam uma grande variedade de métodos em seus estudos, porém, a microscopia de luz ou microscopia óptica é a mais acessível e utilizada nos cursos de histologia. Nos laboratórios de histologia ou morfofuncionais (como o nosso!!!), os estudantes utilizam a microscopia de luz, ou com uma frequência crescente, a microscopia virtual, que representa um método de observação de espécimes microscópicos digitalizados, em uma tela de computador ou dispositivos móveis.
A microscopia eletrônica foi um grande passo para o detalhamento da microanatomia, utilizando o microscópio eletrônico de transmissão (MET) e o microscópio eletrônico de varredura (MEV). Atualmente, com os avanços tecnológicos, o microscópio de força atômica (MFA) também é utilizado e fornece imagens com uma resolução incrível.
É importante entender que inicialmente vários estudantes se deparam com alguns problemas que é compreender a natureza da imagem microscópica que é bidimensional. Além disso, precisam perceber como as imagens se relacionam com a estrutura tridimensional de onde foram obtidas. Portanto, os próximos tópicos dessa página, apresentam uma rápida descrição dos métodos por meio dos quais são produzidas as lâminas e amostras que utilizaremos de maneira mais frequente em nosso laboratório morfofuncional.
1. Coloração
VOCÊ JÁ SE PERGUNTOU COMO É FEITA A LÂMINA HISTOLÓGICA QUE ESTÁ NA SUA MESA? SE NÃO, VAMOS CONVERSAR SOBRE O ASSUNTO NESSA SESSÃO DO SITE.
Primeiramente, devemos pensar o processo de produção desse material ou espécime de 3 formas:
1. O que é preciso fazer antes de cortar o tecido?
2. O que precisa ser feito para colocá-lo na lâmina?
3. E por fim, o que garante que esse tecido vai ficar ali, no local que colocamos?
Então, vamos lá, geralmente, um tecido fresco colocado sob o microscópio de luz não apresenta limites definidos e muito menos diferenciação entre seus componentes. Portanto, para que possamos observar espécimes e analisar suas características precisamos utilizar um corante que diferencie as estruturas a serem observadas.
Os produtos utilizados no exemplo são a hematoxilina e eosina (HE), pois esta é a coloração que é vista com mais frequência nos laboratórios e em livros, no entanto os passos podem se manter pra outros corantes (podendo aumentar alguns passos, e variando certos produtos). Inicialmente, o objetivo é preservar o tecido ao máximo para que seu aspecto fique mais próximo do que era ao ser retirado, então se inicia um processo denominado fixação, no qual o tecido é imediatamente imerso em um fixador (que pode ser uma ou a mistura de algumas substâncias; um exemplo amplamente utilizado é o formol*) que tem como objetivo de preservar o tecido. O fixador vai preservar a amostra, pois, age interrompendo o metabolismo das células, evita a degradação enzimática e consequentemente a autólise (autodigestão), mata os microrganismos patogênicos que poderiam contaminar o tecido e, por fim, enrijece o tecido por desnaturar as proteínas.
*OBS: O formol é uma solução aquosa de um aldeído, o qual apresenta um Carbono (CH2O) também chamado de formaldeído.
Posteriormente, o objetivo é o corte da peça. Inicialmente, lava-se a amostra pra uma posterior desidratação que consiste em seguidas aplicações de soluções alcoólicas, até então chegar ao álcool absoluto (teoricamente isento de água). Porém, esse álcool não pode ficar na peça, logo, ocorre um processo denominado clarificação na qual os solventes orgânicos são empregados para retirar o álcool, para só então haver a infiltração por parafina*. Ai sim, a peça pode ser passada por um equipamento, o micrótomo, para ser cortada, e em seguida colocadas em lâminas de vidro.
*OBS: existe outras formas, no qual o tecido é endurecido com congelamento para então poder ser cortado em um equipamento denominado criostato.
NÃO SE DESESPEREEEEE!!!!!
Muitas vezes quanto analisamos algumas estruturas não a reconhecemos, pois não nos parece familiar as que foram mostrados pelo professor ou observada nos livros. Por que será que isso acontece?
Quando o especialista vai cortar a peça não tem como ele tem controle de como o corte vai ser realizado em cada estrutura que compõe o tecido, ou seja, existe uma infinidade de dimensões a serem cortadas, por isso que determinadas estruturas podem aparecer com algumas diferenças de uma imagem para outra, devido ao ângulo da estrutura que o corte pegou. A imagem abaixo ilustra isso:
Exemplo de uma laranja e de um corpúsculo renal. As linhas tracejadas desenhadas na laranja inteira indica o plano de corte que se correlaciona a cada uma das superfícies de corte. (imagem retirada do livro Histologia: Texto e Atlas – Ross. 6 ed, 2012).
Por fim, há necessidade da coloração tendo em vista que os tecidos após todo esse processo são incolores. Após lavar a lâmina com solventes orgânicos para retirar a parafina, faz-se a coloração que normalmente é realizada com o uso de dois corantes, no qual o segundo é chamado de contraste. Os corantes podem ser divididos em ácidos (aniônico, ou seja, negativamente carregados), como a eosina de cor rosa, que vão interagir com porções positivas das células; ou básicos (catiônicos, ou seja, positivamente carregados), exemplo a hematoxilina na cor roxa, que reage com as porções negativas. A imagem abaixo exemplifica visualmente o porquê de se usar um corante contraste:
Coloração somente com hematoxilina
Coloração somente com eosina
Coloração com hematoxilina-eosina
Série de imagens do pâncreas em cortes seriados (adjacentes) corados com hematoxilina e eosina. 480X. (imagem retirada do livro Histologia: Texto e Atlas – Ross. 6 ed, 2012).
2. Microscopia
Com a tecnologia da microscopia nós podemos observar os objetos com tamanhos aumentados; os óculos, são exemplos amplamente disseminados dessa tecnologia, no entanto, falaremos aqui dos microscópios. Esses equipamentos são bem antigos, as ilustrações microscópicas são datadas por volta de 1555. Nos dias atuais nós temos dois tipos de microscópicos que são o óptico e o eletrônico, ambos apresentam inúmeros exemplos de cada tipo.
Iniciaremos com a microscopia óptica, por ser a mais utilizada, esses são equipamentos que utilizam luz visível ao olho humano. E, os equipamentos, por apresentarem mais de uma lente são denominados microscópio óptico composto. Dentre esse grupo, podemos citar exemplos como a microscopia de campo claro, escuro, contraste de fase, contraste de interferência diferencial, fluorescência.
Conhecendo o Microscópio Óptico
As imagens abaixo são fotografias dos microscópios utilizados em nosso laboratório. Será que você consegue identificar as suas partes? Passe o mouse sobre a seta para visualizar a nomenclatura e clique na seta para visualizar a descrição da peça.
Geralmente, as partes de um microscópio são divididas em partes ópticas (lentes oculares, lentes objetivas, condensador, diafragma e fonte luminosa) e partes mecânicas (pé ou base, braço ou coluna, platina ou mesa, revólver ou tambor, tubo ou canhão, Charriot ou parafuso, parafuso macrométrico, parafuso micrométrico).
Compreendendo o Funcionamento do Microscópio Óptico
O que nos garante enxergar imagens ao microscópio?
Quando a lâmina é atravessada pelo raio de luz, emitido pela fonte luminosa, deve apresentar um pequeno tamanho de comprimento de onda, para que quando esta venha a passar pelo tecido apresente uma maior resolução.
Nota: Resolução tem como definição a capacidade de enxergar dois pontos como unidades separadas e distintas (Black, 1998).
A física tem dessas, mas vamos tentar compreender com a analogia trazida na imagem abaixo:
Retirada de BLACK, 1999.
Já sabemos como é garantida a qualidade na imagem, mas se repararmos um microscópio iremos rapidamente perceber que este apresenta uma grande quantidade de lentes. Por que será? Claramente, você (leitor), há de me responder que é pra aumentar a imagem (obviamente). Sim, você está correto, porém analisando mais profundamente percebemos que essa quantidade de lentes nos garante um jogo de imagem fantástico que será explicado por passos.
Inicialmente, a luz que passou através da lâmina e chega as lentes objetivas vão formar uma imagem aumentada, essas lentes iniciais apresentam aumentos de 4x, 10x, 40x e 100x (em nossos microscópios); no entanto, essa imagem é invertida. Nesse momento entram em ação as lentes oculares, pois essa imagem invertida que chamaremos de imagem 1, vai ser formada e refletida por um prisma, então os raios vindos da imagem 1 atravessaram a lente ocular, a aumentará a imagem e ela será invertida novamente (no caso, ficando em pé), essa imagem a qual chamaremos de 2 é a imagem final que é formada na retina.
Pareceu difícil? Vamos tentar facilitar com a imagem abaixo:
Agora que você já conhece o microscópio e a maneira como o material histológico é preparado, vamos colocar essa teoria em prática?
DINÂMICA 1 - COMO A IMAGEM É GERADA?
1. Recorte uma palavra ou apenas uma letra de uma revista ou jornal e posicione-a em uma lâmina de vidro;
2. Fixe o papel colocando uma gota de água sobre ele;
3. Como o material preparado não será preservado por muito tempo, não será necessário cobrir com a lamínula. Caso contrário, teríamos que utilizar a lamínula para preservação do material;
4. Agora esse material está pronto para visualização. Posicione a lâmina na platina, puxando a presilha. Lembre-se de começar utilizando a objetiva de menor aumento;
5. Primeiramente, para facilitar a busca pelo foco, posicione a luz do microscópio passando pelo centro da lâmina. Para isso, utilize o Charriot;
6. Agora você pode começar a ajustar o foco. O ajuste inicial é feito utilizando o parafuso macrométrico (A), até que uma imagem comece a se formar. Formada a imagem, agora você pode realizar o ajuste fino da imagem para que o foco seja alcançado com mais nitidez. Para isso, utilize o parafuso micrométrico (B);
A
B
7. Prontinho, essa é a imagem que você provavelmente vai visualizar!!!
Observe que a imagem formada está invertida. Por que????
DINÂMICA 2 - UTILIZANDO CORANTES
1. Realizando a próxima dinâmica ficará claro por que utilizar corantes no preparo de células e tecidos é tão importante.
2. Escolha um voluntário;
3. Calce as luvas de procedimento e com o "swab" ou haste de algodão, passe na parte interna da bochecha do voluntário, realizando movimento circulares com a haste;
4. Fazer um esfregaço, girando a haste de algodão com o material coletado da bochecha em uma lâmina de vidro;
5. Posicione a lâmina ao microscópio e tente visualizar o material. Você observará uma imagem semelhante a essa...
As células são facilmente observadas? Podemos delimitar seus limites e núcleo? Pois é, por isso, precisamos submeter a maioria* do material histológico à coloração.
* algumas preparações não necessitam corantes, como o osso desgastado.
6. Retire a lâmina do microscópio;
7. Coloque-a sobre a bancada e fixe o material mergulhando a lâmina no álcool 70% e aguarde 1 minuto;
8. Retire a lâmina do álcool e pingue algumas gotas de corante (p. ex. azul de metileno) sobre o material do esfregaço;
9. Aguarde 1 minuto e com o auxílio de uma pisseta, remova o excesso de corante com um jato de água destilada;
10. Retire a lâmina e escorra o excesso de líquido em um papel toalha;
11. Como não vamos manter a preparação por muito tempo, não será necessário o uso de lamínula;
12. Observe a preparação ao microscópio.
100X
100X
400X
E agora? Ficou mais fácil visualizar as células??? Por que???
BOM ESTUDO!!!
Todos os textos foram cuidadosamente elaborados e/ou revisados pela Profa. Dra. Giulianna R. Borges do Laboratório Morfofuncional e Microscopia da Universidade Federal de Sergipe/Campus Lagarto e membros da LAFIC e/ou monitores. Qualquer dúvida ou sugestões nos envie um email:
Vídeo aula elaborada pelos Profs. Drs. Luciana Valente e Tiago Gois do Laboratório Morfofuncional e Microscopia da Universidade Federal de Sergipe/Campus Lagarto.
REFERÊNCIAS
1. ROSS H; PAWLINA M. Histologia – Texto e Atlas – Em Correlação com Biologia Celular e Molecular. 6 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2012.
2. BLACK, J.G. Microbiologia Fundamentos e Perspectivas. 4 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1999.
3. JUNQUEIRA, L C U; CARNEIRO, J. Histologia Básica. 12. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.
